МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА Утверждаю И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ Зам. руководителя РОССИСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамента ветеринарии (Минсельхозпрод России) В.В.Селиверстов Департамент ветеринарии 13-7-2/1759 от 11.10.99 Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями 1. Общие положения 1.1. Смешанная кишечная инфекция - остропротекающая инфекционная болезнь молодняка разных видов сельскохозяйственных животных, которая имеет полиэтиологическую природу и вызывается двумя-тремя и более видами патогенных энтеробактерий, относящимся к родам escherichia, citrobacter, proteus, morganella, klebsiella, salmonella. Помимо указанных микроорганизмов возбудителями болезни могут быть также бактерии других родов и семейств - yersinia, pseudomonas, staphylococcus, streptococcus, clostridium и пр. Наряду с бактериальными агентами нередко (особенно на крупных фермах) болезнь обусловливают корона- и ротавирусы. 1.2. Болезнь возникает в первые дни и недели жизни животных и проявляется чаще в виде энзоотической вспышки, развитию которой способствуют различные факторы, связанные с несоблюдение заметного агглютината на стекле спустя 1-3 мин. после смешивания компонентов. 1.3. Компонентами реакции являются: испытуемый материал (чистая или смешанная культура бактерий) и коагглютинирующие морганеллезные, сальмонеллезные и эшерихиозные диагностикумы (2%-ная взвесь убитого стафилококка штамма cowan-1, сенсибилизированная антителами специфической агглютинирующей сыворотки). 2. Приготовление коагглютинирующих морганеллезных, сальмонеллезных и эшерихиозных диагностикумов 2.1. Для приготовления коагглютинирующих диагностикумов используют морганеллезные агглютинирующие О-сыворотки серогрупп О1, О16, О26, О29, О33, О45, О49, «13»; сальмонеллезные агглютинирующие О-сыворотки рецепторов 4, 7, 8, 9, 3-10 и поливалентную сыворотку (серогрупп b1, c1, С2, d1, e1); эшерихиозные антиадгезивные агглютинирующие сыворотки К88, К99, 987Р, f41, f18, А20, изготовленные биопредприятиями. 2.2. Коагглютинируюшие морганеллезные, сальмонеллезные и эшерихиозные диагностикумы готовят на местах использования в соответствии с «Наставлением по применению стафилококкового реагента, содержащего белок А, сухой», которое прилагается к коробке с флаконами соответствующего препарата, изготовленного биопредприятием. Для этого к содержимому флакона с сухим стафилококковым реагентом добавляют 2 куб.см дистиллированной воды и оставляют его на 2-3 ч. с целью регидратации, флаконы периодически встряхивают для лучшего растворения реагента. Полученную после регидратации 10%-ную взвесь стафилококков разливают по 1 куб.см в центрифужные пробирки, добавляют в каждую по 9 куб.см дистиллированной воды, размешивают стеклянной палочкой и затем дважды отмывают от наполнителя путем центрифугирования при 3-4 тыс. об/мин в течение 20 мин. После каждого отмывания клеток стафилококков надосадочную жидкость уничтожают. 2.3. Отмытый осадок стафилококков в центрифужной пробирке ресуспендируют в 1 куб.см забуференного физиологического раствора (рН 7,0-7,2), получая исходную 10% взвесь, к которой добавляют 0,1 куб.см специфической агглютинирующей сыворотки, компоненты размешивают путем встряхивания пробирки и оставляют смесь при комнатной температуре на 30-40 мин, после чего ее центрифугируют при 3-4 тыс. об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость сливают и уничтожают. 2.4. К осадку сенсибилизированного стафилококка в центрифужной пробирке добавляют 10 куб.см забуференного физиологического раствора (рН 7,0-7,2), тщательного размешивают стеклянной палочкой, а затем центрифугируют взвесь при режиме, указанном в п.2.3. Отмывание бактерий от остатков сыворотки проводят дважды при аналогичном режиме, надосадочную жидкость сливают и уничтожают. 2.5. Осадок отмытых сенсибилизированных клеток стафилококков ресуспендируют в 5 куб.см забуференного физиологического раствора (рН 7,0-7,2) и к полученной 2%-ной взвеси добавляют 1-2 капли 1%-ного раствора мертиолята с целью консервирования диагностикума. Коагглютинирующие диагноста кумы ко всем серогруппам морганелл, сальмонелл и разным типам адгезивных антигенов энтеропатогенных эшерихий готовят по аналогичной методике. Приготовленные диагностикумы хранят при температуре 4-6 гр.С в течение трех месяцев. 2.6. Одновременно для контроля из сухого препарата готовят взвесь несенсибилизированного стафилококка как указано в п.2.2, затем осадок бактерий ресуспендируют в забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,2) до получения 2%- ной концентрации и консервируют мертиолятом как указано в п.2.5. 3. Отбор и подготовка проб для исследования в реакции коагглютинации 3.1. Материалом для исследования служат пробы фекалий больных диареей животных, патологический материал от павших или убитых с диагностической целью животных и птиц, корма, сборные пробы соскобов с полов клеток и станков для содержания животных и птицы, смывы с помещений и оборудования животноводческих ферм и птицефабрик. 3.2.Пробы фекалий от больных диареей и содержимое тонкого отдела кишечника погибших животных разводят в стерильном физиологическом растворе 1:20 — 1:30, а затем засевают суспензию бактериологической петлей широкими частыми штрихами на плотные селективные питательные среды Б чашках (агар Эндо, Минка, среду Плоскирева). Посевы из внутренних органов и тканей животных и птиц, погибших от диареи, проводят в соответствии с действующими методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза), сальмонеллеза и других заболеваний, вызываемых патогенными энтеробактериями. При исследовании кормов на наличие сальмонелл используют общепринятые среды обогащения (селенитовый бульон, среды Мюллера, Кауфмана, магниевую или др.), посевы проводят согласно существующему ГОСТу. Каждую сборную пробу соскобов с полов клетки или станка берут из 3-участков в стерильную пробирку в количестве 2-3 г, тщательно перемешивают предварительно профламбированной стеклянной палочкой, затем разводят стерильным физиологическим раствором 1:20 - 1:30. Сборные смывы с поверхности помещения и оборудования делают также в 3-5 участках объекта стерильными увлажненными марлевыми тампонами (каждый смыв с площади 5х10 см), которые помещают в пробирку с 8-10 куб.см стерильного физиологического раствора. Перед исследованием пробы тампоны извлекают из пробирки стерильным пинцетом и отжимают. 3.3. Исследованию в РКОА подлежат первичные 16-18 час культуры бактерий (чистые или смешанные), полученные на питательных средах, применяемых для выделения искомых бактерий из патологического материала, кормов и объектов внешней среды. Для обнаружения морганелл используют культуры на агаре Плоскирева, сальмонелл -культуры в средах обогащения и на агаре Плоскирева, энтеропатогенных эшерихий с адгезивными антигеноми К88, 987Р, А20 - на агаре Эндо (или Левина); энтеропатогенных эшерихий с адгезивными антигеноми К99, f41, f 18 - культуры на агаре Минка. С культур на плотных селективных средах делают смыв стерильным физиологическим раствором (рН 7,0-7,2), который наливают в чашку с культурой в количестве 3-5 куб.см (в зависимости от интенсивности ее роста), а затем стеклянным шпателем, приготовленным из пастеровской пипетки, смывают колонии с поверхности среды и тщательно их эмульгируют. 4. Исследование культур в реакции коагглютинации и оценка результатов 4.1. На чистую обезжиренную стеклянную пластину размером 9х12 — 10х15 см наносят (в зависимости от цели исследования) по 1 капле коагтлютинирующих моргаиеллезных (8 типов), поливалентного сальмонеллезного или эшерихиозных 6 типов диагностикумов и по 1 капле испытуемой взвеси бактерий. Компоненты тщательно перемешивают бактериологической петлей, которую после соприкосновения с каждым типом диагностикума фламбируют. 4.2. Учет результатов реакции проводят спустя 2-3 мин. после смешивания компонентов по следующим показателям: - положительная реакция - наличие мелко или крупнозернистого агглютината и просветление смеси (обозначается знаком «+»); - сомнительная реакция - едва заметный агглютинат, просветление смеси незначительное (обозначается знаком «±»); - отрицательная реакция — отсутствие агглютината и просветления смеси (обозначается знаком «-»). 4.3. При положительной реакции испытуемой культуры бактерий с поливалентным сальмонеллезным коагглютинирующим диагностикумом ставят реакцию с моновалентными сальмонеллезными диагностикумами типов 4, 7, 8, 9, 3-10 как указано в п.4.1 с целью ее серогрупповой идентификации. 4.4. В тех случаях, когда испытуемый материал дает положительную реакцию с коагглютинирующими диагностикумами, ставят следующие три контроля с целью исключения неспецифической агглютинации: - коагглютинирующий диагностикум + забуференный физраствор, - испытуемый материал + забуференный физраствор, - испытуемый материал + несенсибилизированный стафилококковый реагент. Все компоненты используют в количестве по 1 капле (0,05 куб.см). 4.5. Заключение о наличии в испытуемом материале бактерий родов morganella и salmonella, а также энтеропатогенных эшерихий с адгезивными антигенами делают на основании положительного результата РКОА и отсутствия агглютинации во всех контролях. 5. Способ постановки реакции коагглютинации путем одновременного смешивания несенсибилизированного стафилококкового реагента, специфической агглютинирующей сыворотки и испытуемого материала 5.1. Ускоренную индикацию морганелл, сальмонелл и энтеропатогенных эшерихий с адгезивньми антигенами можно проводить как общепринятым методом постановки РКОА, так и другим способом, при котором отпадает необходимость предварительно готовить специфический коагглютинирующий диагностикум. В последнем случае для постановки реакции применяют три компонента: 2%-ную взвесь несенсибилизированного стафилококкового реагента (приготовленного для контроля как указано в п.2.6), специфическую агглютинирующую сыворотку и испытуемый материал. 5.2. Для постановки реакции на чистую обезжиренную стеклянную пластину наносят одновременно по 1 капле (0,05 куб.см) вышеуказанных компонентов, которые тщательно размешивают бактериологической петлей до получения гомогенной взвеси. Специфические агглютинирующие сыворотки предварительно разводят стерильным забуференным физраствором (рН 7,0-7,2) и используют в следующих разведениях: морганеллезные - 1:50, сальмонеллезные - 1:10, эшерихиозные - 1:20. Учет результатов реакции проводят по показателям, указанным в п.4.2. 5.3. При получении положительного результата реакции ставят следующие три контроля с целью исключения неспецифической агглютинации: - специфическая агглютинирующая сыворотка в рабочем разведении + несенсибилизированный стафилококковый реагент, испытуемый материал + забуференный физраствор, - несенсибилизированный стафилококковый реагент + забуференный физраствор. Все компоненты используют в количестве по одной капле (0,05 куб.см). 5.4. Заключение о результатах исследования делают согласно п.4.5. 5.5. Положительный результат в РКОА, полученный при индикации сальмонелл и морганелл в патологическом материале от больных и погибших животных и птиц, а также в кормах следует рассматривать как сигнальную оценку, на основе которой пробы этих материалов подвергают полному бактериологическому исследованию общепринятыми методами для подтверждения наличия сальмонелл и морганелл в указанных материалах и установления видовой принадлежности выделенных культур, а для сальмонелл еще и серовара на основе изучения их морфологических, тинкториальных, ферментативных свойств и определения антигенной структуры с монорецепторными агглютинирующими О- и Н-сыворотками. Методические указания разработаны Л.С.Кавруком, А.Б.Кононенко, С.В.Бритовой (ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии). С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу "Методические указания по ускоренной индикации морганелл, сальмонелл и энтеропатогенных эшерихий с адгезивными антигенами К88 и К99 в объектах внешней среды, кормах и патологическом материале при помощи реакции коагглютинации", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 18 января 1989г. Приложение РЕЦЕПТЫ приготовления забуференного физиологического раствора и агара Минка 1. Забуференный физиологический раствор 1.1. Для получения забуференного физраствора с рН 7,0-7,2 дистиллированную воду подвергают кипячению в течение 10-15 мин, после чего ее используют для приготовления обычного физраствора, содержащего 0,85% хлорида натрия. 1.2. К 1 куб.дм физраствора добавляют 10 куб.см смеси 1/15 М растворов двузамещенного фосфорнокислого натрия (na2hp04x12h20) и однозамещенного фосфорнокислого калия (КНзР04) в соотношении 7:3 или 8:2 (в зависимости от исходной величины рН воды), компоненты в колбе тщательно размешивают. 1.3. 1/15 М растворы солей готовят следующим образом; в две колбы наливают по 1 куб.дм дистиллированной воды, затем в первую колбу добавляют 23,0 г na2hp04xl2h20, а во вторую колбу 9,0 г КН2РО4, отверстия колб закрывают резиновыми или корковыми пробками и встряхивают их для размешивания компонентов. Хранят растворы в темном месте при комнатной температуре в течение 6 мес. 2. Агар Минка для формирования адгезивных антигенов эшерихий К99, f41, f18. 2.1. Для приготовления среды вначале готовят следующие исходные растворы: а) фосфатно-буферный раствор с рН 7,4-7,5. Для его приготовления предварительно получают 1/15 М растворы двузамещенного фосфорнокислого натрия (na2hpО4x12Н2o) и однозамещенного фосфорнокислого калия (КнзРО4). С этой целью добавляют к 1 куб.дм дистиллированной воды 23 г na2hpО4 (в первую колбу) и 9 г КН2РО4 (во вторую колбу), компоненты растворяют путем встряхивания колб. Колбы с полученными 1/15 М растворами солей закрывают резиновыми или корковыми пробками и хранят в темном месте при комнатной температуре в течение 6 месяцев. Для получения фосфатно-буферного раствора с рН 7,4 - 7,5 к 1 куб.дм дистиллированной воды добавляют 10 куб.см смеси 1/15 М растворов na2hpО4 и КН2РО4 в соотношении 9:1, компоненты в колбе тщательно перемешивают. б) Раствор микроэлементов: марганец хлористый (МnС12 х 4Н2О) - 0,1г, магний сернокислый (mgsО4 x 7h2О) - 1 г, кальций хлористый (cacl2 х 6Н2О)- 0,04 г, железо хлорное (РеС13 х 6Н2О)- 0,02 г, вода дистиллированная - 100 куб.см Компоненты тщательно перемешивают в воде, отверстие колбы закрывают резиновой или корковой пробкой, хранят раствор микроэлементов при комнатной температуре в течение 1 месяца. в) 4%-ный раствор агар-агара. Для его приготовления в колбу с 1 куб.дм дистиллированной воды добавляют 40 г предварительно отмытого агар-агара, колбу нагревают до полного расплавления агара, затем фильтруют через ватный фильтр и стерилизуют при 1 атм. (121°С) в течение 30 минут. Перед употреблением застывший агар расплавляют в водяной бане. 2.2. Среду Минка готовят по следующему рецепту: фосфатно-буферный раствор (рН 7,4 - 7,5) - 950 куб.см, раствор микроэлементов - 2 куб.см, 40%-ный раствор глюкоз - 25 куб.см, 10%-ньй раствор дрожжевого экстракта (*) - 10 куб.см, 10%-ный раствор гидролизата казеина (**) - 20 куб.см (*), (**) — для приготовления среды используют экстракт дрожжевой, сухой, очищенный - ТУ 6-09-4510-77 и сухой гидролизат казеина - ТУ 6-09-4764-79]. Компоненты в колбе размешивают, затем нагревают смесь до температуры 45 - 50°С, после чего к ней добавляют 1 дм расплавленного 4%-ного раствора агар-агара. Готовую среду (2%-ный агар Минка) разливают в колбы по 100-200 куб.см и стерилизуют при 0,5 атм. (110°С) в течение 15 мин., хранят среду не более 1,5 мec. Перед употреблением ее расплавляют в водяной бане и разливают в стерильные чашки Петри.