Продолжение
4.2.6. Учет результатов прямой ИФ. Диагноз на хламидиоз считается
положительным, если в препарате диагностируют наличие элементарных
телец хламидий, расположенных внеклеточно и представляющих собой яр-
ко-зеленые образования округлой формы с ровными краями, размером
около 300 мкм (приблизительно 1/100 от окружающих эпителиальных кле-
ток). Иногда наблюдаются ретикулярные тельца хламидий, размеры кото-
рых в 2-3 раза больше элементарных. Внутриклеточные включения выяв-
ляются не более, чем в 10% случаев.
Диагноз на хламидиоз считается отрицательным, если в препарате
отсутствует специфическое ярко-зеленое свечение при наличии красных
эпителиальных клеток. Для того, чтобы отрицательный диагноз можно было
считать достоверным, рекомендуется просматривать все поле мазка не ме-
нее 5 мин.
В качестве отрицательного контроля проводят микроскопию мазков,
приготовленных из конъюнктивы заведомо здоровых животных, специфиче-
ское ярко-зеленое свечение при наличии красных эпителиальных клеток
должно отсутствовать.
Любой флюоресцирующий материал неправильной формы или дру-
гого цвета, а также имеющий неяркую зеленую окраску, рассматривается
как артефакт
4.2.7. При исследовании препаратов непрямым методом ИФ на фик-
сированный мазок или мазок-отпечаток наносят иммунную хламидийную
нефлуоресцирующую сыворотку и выдерживают его во влажной камере при
тех же условиях. Затем промывают физиологическим раствором и высуши-
вают.
Для контроля на другой препарат наносят контрольную отрицатель-
ную сыворотку, выдерживают во влажной камере, затем окрашивают флуо-
ресцирующей антивидовой сывороткой.
При наличии в препаратах антигена хламидий обнаруживают специ-
фическое свечение в виде желто-зеленых гранул округлой и овальной
формы на тусклом зеленовато-сером фоне. В контрольном препарате спе-
цифическое свечение должно отсутствовать.
5. Выделение хламидий из патологического материала и их идентификация.
5.1. Подготовка материала. Из патологического материала готовят
10% суспензию на стерильном физиологическом растворе рН 7,2-7,4 и
центрифугируют ее при 2000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жид-
кость переносят в стерильные пробирки (флаконы) и вносят в нее анти-
биотики: 500 мг/куб.см стрептомицина 150 мг/куб.см гентамицина или 500
ед/куб.см. канамицина. Пробы экссудата (в нативном виде или разведенные 1:2 сте-
рильным физраствором) обрабатывают теми же антибиотиками; выдер-
живают при 4 °С в течение 2 часов и высевают на питательные среды
(МПА, МПБ) для исключения бактериального загрязнения. Через сутки при
отсутствии роста микрофлоры на питательных средах материал исполь-
зуют для заражения куриных эмбрионов или лабораторных животных.
5.2. Выделение хламидий на куриных эмбрионах (КЭ). Исследуемый
материал, подготовленный как указано в пункте 5.1, вводят в объеме
0,2 куб.см в желточный мешок 6-7-дневным КЭ. Каждым материалом заражают
не менее 6 эмбрионов. Для контроля оставляют такое же количество
незараженных эмбрионов. Инкубируют КЭ в термостате при 37 °С в течение
7 дней.
Гибель эмбрионов в первые двое суток после заражения считают
неспецифической. Эмбрионы, погибшие на 4-7 день после заражения,
вскрывают с соблюдением правил асептики, отбирают в стерильную посуду
желточные мешки.
Из желточных мешков готовят мазки или мазки-отпечатки и
окрашивают по Романовскому-Гимзе или моноклональными антителами,
меченными ФИТЦ, и проводят идентификацию хламидий методом световой
или люминесцентной микроскопии(п.п. 4.1; 4.2).
При отсутствии специфической гибели эмбрионы на 7 день вскры-
вают и проводят второй пассаж по общепринятой методике. Для заражения
используют центрифугат 10% суспензии желточных мешков, который
предварительно обрабатывают антибиотиками и проверяют на отсутствие
бактериальной контаминации. При пассажах специфическая гибель КЭ
может наблюдаться на 3-7 сутки после заражения. Из желточных мешков
погибших эмбрионов готовят мазки или мазки-отпечатки, окрашивают и
исследуют методом световой или люминесцентной микроскопии.
При отсутствии специфической гибели эмбрионов во втором пассаже
проводят третий пассаж
Обнаружение хламидий или антигенов хламидий или ДНК хламидий в
мазках-отпечатках или патматериале из желточных мешков эмбрионов в
любом из трех последовательных пассажей считают положительным
результатом.
5.3. Выделение хламидий из лабораторных животных Для выделения хламидий
из патологического материала заражают не менее четырех белых мышей весом
5-10 г. Исследуемый материал, подготовленный как указано в п. 5.1., вводят
внутрибрюшинно в дозе 0,5-1,0 куб.см или в мозг в дозе 0,03 куб.см.
При внутрибрюшинном заражении животные находятся под наблю-
дением в течение 10 дней. У больных и павших мышей при вскрытии обна-
руживают скопление экссудата в брюшной полости, увеличение селезенки
и печени, очаговую гиперемию легких.
При заражении животных в мозг наблюдение за ними проводят в те-
чение 7 дней. Животные погибают с клиническими признаками энцефалита.
Из пораженных органов (паренхиматозных органов или оболочек
мозга) и экссудата готовят мазки или мазки-отпечатки, и исследуют с помо-
щью световой или люминесцентной микроскопии на наличие хламидий или
их антигенов.
При отсутствии специфической гибели животных убивают эфиром
или хлороформом и проводят второй пассаж на том же виде и количестве
животных. Для внутрибрюшинного заражения используют центрифугат
10%-ной суспензии паренхиматозных органов мышей, зараженных в первом
пассаже; при заражении в мозг - центрифугат 10%-ной суспензии из обо-
лочек головного мозга.
Из пораженных органов больных или павших мышей готовят мазки-
отпечатки и исследуют методом световой или люминесцентной микроско-
пии.
При отсутствии специфической гибели животных во втором пассаже
проводят третий пассаж.
Результаты исследования считают положительными в случае обна-
ружения хламидий или их антигенов или ДНК хламидий в мазках-отпечатках
или в патматериале из органов больных или павших животных в любом из
трех последовательных пассажей.
6. Выявление и идентификация ДНК c.psittaci методом полимеразной цеп-
ной реакции (ПЦР)
6.1 Метод предназначен для выявления ДНК c.psittaci с помощью
ПЦР в патологическом материале от птиц. В основе метода лежит
многократное повторение циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе
при температуре 95 °С, отжига специфических олигонуклеотидных затравок
(праймеров) при температуре 62 °С и синтеза комплементарных цепей ДНК
с помощью фермента при температуре 72 °С.
В качестве неконкурентного внутреннего стандарта используется
фрагмент неспецифической ДНК фага лямда, позволяющий контролировать
эффективность протекания всего процесса для каждой исследуемой пробы.
Метод предназначен для идентификации хламидий методом ПЦР.
6.2. В ПЦР используют следующие наборы:
1) набор для выделения ДНК, " ДНК-сорб-ПЦР ",
2) набор для ПЦР-амплификации участка ДНК хламидий,
3) набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР.
6.2.1. Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:
- лизирующий раствор -1 пробирка, 30 куб.см;
- отмывочный раствор №1-1 пробирка, 20 куб.см;
- концентрат для отмывочного раствора №2 -1 пробирка, 20 куб.см;
- суспензия сорбента - 2 пробирки по 2 куб.см;
- буфер для элюции ДНК с сорбента - 2 пробирки по 5 куб.см.
Дополнительно необходим 96%-ный этанол (ректификат), 100 куб.см.
6.2.2. Набор для проведения ПЦР состоит из следующих
компонентов:
- смесь праймеров "chla" -1 пробирка, 0,25 куб.см;
- смесь праймеров "ВС-Л" -1 пробирка, 0,25 куб.см;
- смесь нуклеотидов -1 пробирка, 0,5 куб.см;
- 5-кратный реакционный буфер -1 пробирка, 1,0 куб.см;
- деионизованная вода -1 пробирка, 2 куб.см;
- фермент taq-полимераза -1 пробирка, 0,1 куб.см;
- положительная контрольная ДНК (ДНК c.psittaci) -1 пробирка,
0,2 куб.см;
- ДНК внутреннего стандарта (ДНК ВС-Л) -1 пробирка, 1,0 куб.см;
- воск для ПЦР - 2 пробирки по 1,0 куб.см;
- масло минеральное -1 пробирка, 5,0 куб.см.
6.2.3. Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР
состоит из следующих компонентов:
- концентрат буфера с бромидом этидия - 3 флакона по 25 куб.см;
- агароза для электрофореза - 3 пробирки по 2 г.
6.3. Отбор материала для исследования.
6.3 1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб
для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие
обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом
действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.
6.3.2. Для исследования используют: соскобы с конъюнктивы и
клоаки, биоптаты (кусочки паренхиматозных органов), помет.
6.3.3. Жидкости для исследования отбирают в объеме 20 куб.см, из
тканей и органов вырезают кусочки размером 3х3х3 см (при невозможности
толщина кусочков может быть меньше).
6.3.4. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на
следующий день, сохраняя при 4 °С. Допускается хранение материала при
минус 20 °С в течение 30 дней.
6.4. Подготовка исследуемого материала.
6.4 1. Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся
пипеточными дозаторами переменных объемов (типа "Ленпипет") с исполь-
зованием одноразовых полипропиленовых пробирок на 1,5 куб.см и 10,0 куб.см
(ПО "Ленполимер") и наконечников с аэрозольным барьером. Одноразовая
пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна сбрасываться в спе-
циальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор
хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б.
6.4.2. Пробы исследуемых жидкостей, в объеме 10 куб.см центрифуги-
руют при 3000 об/мин в течение 10-15 мин. При необходимости объем
проб доводят до требуемого путем добавления физиологического раствора
Супернатант осторожно сливают, оставив над осадком примерно 0,5 куб.см
жидкости. Если осадок практически не виден, то в эту же пробирку вносят
еще 10 куб.см материала и повторяют центрифугирование. Осадок суспенди-
руют в оставшейся надосадочной жидкости, переносят в пробирку
"эппендорф" и осаждают на микроцентрифуге при 11000 об/мин в течение
8-10 мин. Супернатант отбрасывают, осадок ресуспендируют в 100 мкл фи-
зиологического раствора и используют для выделения ДНК.
6.4.3. Пробы паренхиматозных органов, плодовых оболочек, разме-
ром 3х3х3 мм помещают в пробирки типа "эппендорф", тщательно расти-
рают отдельными стеклянными палочками, добавляют по 1 куб.см физиологи-
ческого раствора и тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при тем-
пературе 20-25 °С в течение 30 мин, после чего верхнюю фазу переносят в
другие пробирки "эппендорф" и центрифугируют при 11000-12000 об/мин в
течение 8-10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок ресуспен-
дируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения
ДНК.
6.4.4 Соскоб слизистых оболочек разводят в 0,5-1,0 куб.см физиологи-
ческого раствора, осаждают на микроцентрифуге при 11000-12000 об/мин в
течение 3-5 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспен-
дируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения
ДНК. Если слизь очень густая (не всасывается в отверстие наконечника пи-
петки), то пробу обрабатывают 1-2 куб.см раствора 0,1М меркаптоэтанола,
добавив его в "эппендорф". Размешивают на вортексе, выдерживают при
комнатной температуре 3-5 мин. и центрифугируют в вышеуказанном режи-
ме. Осадок в 100 мкл физиологического раствора используют для выделе-
ния.
6.4.5. Пробы помета птиц в количестве 0,1-0,2 г вносят в пробирку с
0,5 куб.см физиологического раствора, тщательно перемешивают и осаждают
на микроцентрифуге при 2000 об/мин в течение 1 мин. Осадок отбрасыва-
ют, а Супернатант используют для выделения ДНК.
6.5 Проведение ПЦР-анализа.
6.5.1. ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных помеще-
ниях (зонах), для работы в которых дополнительно требуются следующие
материалы и оборудование:
Для выделения ДНК из испытуемого материала - ЗОНА 1:
- настольный бокс с бактерицидной лампой;
- термостат для пробирок типа "эппендорф" на 25-100 °С;
- микроцентрифуга до 12000-16000 об/мин;
- центрифуга/вортекс "Микроспин";
- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема от
0,001 куб.см до 1 куб.см;
- одноразовые наконечники с аэрозольным барьером;
- одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 куб.см типа
"эппендорф";
- штативы для пробирок, наконечников;
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
- холодильник на 2-8 °С с морозильной камерой.
Для проведения амплификации (ПЦР) - ЗОНА 2:
- амплификатор;
- ПЦР-бокс или отдельный стол с УФ-лампой;
- отдельный халат и одноразовые перчатки;
- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема от
0,001 куб.см до 1 куб.см;
- одноразовые наконечники в штативах:
- одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 куб.см;
- штативы для микропробирок на 0,5 куб.см;
- холодильник на 2-8 °С, морозильник на минус 20 °С для выделенных
ДНК;
- термостат для микропробирок с воском на 95 °С.
Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - ЗОНА 3:
- камера для горизонтального электрофореза;
- источник постоянного тока на 150-200 В;
- ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей;
- фотоаппарат для фотографирования гелей и фотопленка;
- бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;
- аквадистиллятор;
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки:
- отдельная автоматическая пипетка 10-40 мкл и наконечники в штативе;
- мерный цилиндр на 1л;
- колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы;
- электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.
6.5.2. Порядок работы.
ЭТАП 1. Выделение ДНК из исследуемого материала.
Выделение ДНК из 100 мкл предварительно подготовленного пато-
логического материала проводят с помощью набора «ДНК-сорб-ПЦР».
Приготовить отмывочный раствор 2, для этого в отдельном флаконе
смешать 20 куб.см концентрата из набора, 80 куб.см дистиллированной воды и
100 куб.см 96% этанола. Хранить раствор при комнатной температуре в плот-
но завинчивающемся флаконе.
Проверить состояние сорбента - при отстаивании он должен занимать
приблизительно половину объема суспензии.
В плотно закрывающуюся полипропиленовую пробирку на 1,5 куб.см
(желательно с завинчивающейся крышкой) внести по 100 мкл
предварительно подготовленной исследуемой пробы, отрицательной или
положительной пробы, добавить по 300 мкл лизирующего раствора (в
каждую пробу отдельным наконечником) и тщательно перемешать
пипетированием 3-10 раз.
Добавить 15-20 мкл ресуспендированного сорбента, хорошо пере-
мешать на вортексе, поставить в штатив на 5-7 мин. для полного осаждения
сорбента.
Осадить сорбент на микроцентрифуге в течение 30 сек. при 3000-
8000 об/мин. Отобрать супернатант из каждой пробирки отдельным
наконечником (удобно успользовать вакуумный отсос).
Добавить по 300 мкл отмывочного раствора 1, перемешать на
вортексе до полного ресуспендирования сорбента (если сорбент плохо
разбивается разбить его при помощи пипетки), осадить на центрифуге при
4000-8000 об/мин в течение 30 сек. Отобрать супернатант из каждой
пробирки отдельным наконечником.
Добавить по 800 мкл отмывочного раствора 2, перемешать на
вортексе до полного ресуспендирования сорбента, осадить на
микроцентрифуге при 6000-10000 об/мин в течение 30 сек, отобрать супер-
натант.
Повторить процедуру отмывки, тщательно отобрать супернатант,
высушить осадок сорбента в термостате при 65 °С, в течение 5 мин.
Ресуспендировать сорбент в 30-40 мкл элюирующего буфера,
поместить в термостат на 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на
вортексе.
Осадить на микроцентрифуге при максимальных оборотах 1 мин.
Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную
ДНК.
В качестве отрицательного контроля на этапе выделения ДНК
необходимо использовать физраствор или деионизованную воду.
Эффективность выделения ДНК с помощью набора «ДНК-сорб-ПЦР»
составляет 30 - 60%.
Клинический или патологический материал
|
Соскоб с конъюктивы или клоаки
|
Биопат, фекалии
|
Число пипетирований
|
5-10 раз
|
10 раз
|
Объем сорбената
|
20 мкл
|
25 мкл
|
Скорость осаждения сорбента
|
6000 об/мин
|
3000-4000 об/мин
|
Объем элюента
|
30-40 мкл
|
40 мкл
|
Эффективность выделения ДНК
|
30-40 %
|
50-60 %
|
ЭТАП 2. Постановка ПЦР (амплификация ДНК).
Пробирку с воском ставят в термостат при 95 °С до полного
расплавления. Готовят "нижнюю" реакционную смесь, используя
стерильные наконечники (полистирол выдерживает автоклавирование при
120°С):
- отдельно для амплификации ДНК c.psittaci: к 0,25 куб.см праймеров
"chla" добавляют 0,25 куб.см нуклеотидов, смешивают на вортексе;
- отдельно для амплификации ДНК ВС-Л: к 0,25 куб.см праймеров "ВС-Л"
добавляют 0,25 куб.см нуклеотидов, смешивают на вортексе.
Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл "нижней" смеси,
наслаивают сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он
полностью накрыл жидкость, закрывают крышки, на верхней части которых
наносят пометки "chla" или "ВС-Л". Если воск покрыл жидкость неровно
или образовались пузыри, прогревают пробирки в амплификаторе 5 мин.
при 95 °С и охлаждают. В таком виде пробирки хранятся в морозильнике
несколько месяцев, можно приготовить сразу 50-100 штук.
Готовят "верхнюю" смесь: к 0,5 куб.см 5-кратного реакционного буфера
добавляют 0,45 куб.см деионизованной воды и 0,05 куб.см taq-полимеразы,
хорошо перемешивают на вортексе. Смесь хранится при 2-8 °С в течение
месяца (не замораживать!). Выставляют два ряда пробирок с "нижними"
смесями ("chla" и "ВС-Л") в штатив по числу испытуемых проб, включая
контрольные из 1-го этапа анализа ("контроли выделения"), и добавляют
пробирки для "контролей ПЦР" (деионизованная вода, ДНК c.psittaci и ДНК
ВС-Л, разведенные деионизованной водой 1:10), нумеруют их
Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10 мкл "верхней" смеси,
при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с "нижней"
смесью. Сверху раскапывают по 1 капле масла. Под масло вносят по
10 мкл проб - испытуемых и контрольных двух этапов анализа (для каждой
пробы две пробирки - из ряда "chla" и ряда "ВС-Л"). Набирают на
амплификаторе нужную программу:
-для c.psittaci:
Амплификаторы с регулиро-
ванием температуры по матрице
(скорость нагрева-охлаждения - не
менее1 °С/сек)
"Ампли-3" (Биоком)"
"minicycler", "ptc-100" (mj
research)
|
Амплификаторы с активным
регулированием (по раствору в
пробирке)
"geneamp psr system 2400"
(perkin elmer)
"omn-e" (hibaid)
"Терцик" (ДНК-технология)
|
95 °С - 2мин 1 цикл
95°С -1 мин.
62°С -1 мин.
72 °С -1 мин 40циклов
10° С -12-14 час (хранение)
|
95 °С - 2 мин 1цикл
95°С-10с,
62° С-10 с,
72 °С-10 с 40циклов
10 °С -12-14 час (хранение)
|
- для ВС-Л:
95 °С - 2мин 1 цикл
95°С -1 мин.
65°С -1 мин.
72 °С -1 мин 40циклов
10° С -12-14 час (хранение)
|
95 °С - 2 мин 1цикл
95°С-10с,
65° С-10 с,
72 °С-10 с 40циклов
10 °С -12-14 час (хранение)
|
Через 1-2 мин после запуска программы, когда температура в ячейке
амплификатора достигнет 95 °С, ставят программу на паузу, помещают
пробирки в ячейки, закрывают крышку прибора, убирают паузу и ждут
окончания реакции (примерно 2,5 часа на амплификаторе с
регулированием температур по матрице и 1 час 40 мин на амплификаторе с
активным регулированием). После окончания реакции (в тот же день или
после хранения утром следующего дня) собирают пробирки в отдельный
пакет и отправляют в комнату для анализа продуктов ПЦР, который
проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле.
Длина амплифицированного специфического фрагмента ДНК:
-c.psittaci -1033 п.н.
-ВС-Л -500 п.н.
ЭТАП 3. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР.
Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в
отдельной комнате лаборантом или сотрудником лаборатории, не
производящим манипуляций в пре-ПЦР помещении ("Правила проведения
работ в диагностических лабораториях, использующий метод
полимеразной цепной реакции. Основные положения.", утвержденные Де-
партаментом ветеринарии МСХиП РФ 27 января 1997 г.№ 13-7-2/840).
В мерный цилиндр наливают 25 куб.см концентрированного буфера,
доводят дистиллированной водой до 500 куб.см, закрывают цилиндр
парафинированной пленкой ("parafilm") и перемешивают. Агарозу из
одной пробирки набора пересыпают в стеклянную колбу из термостойкого
стекла объемом 250 куб.см, наливают 100 куб.см готового буфера и плавят на
кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после этого
кипятят агарозу еще 20 мин и немного остужают, вращая колбу. Заливают
агарозный гель в форму (толщина 5-6 мм), помещают гребенки на
расстоянии не менее 3 см друг от друга.
После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре)
осторожно вынимают гребенки, не повредив лунки. Помещают полосу
готового геля в электрофорезную камеру так, чтобы лунки были обращены
в сторону отрицательного электрода (ДНК из лунок будет двигаться к
положительному электроду). Наливают приготовленного буфера столько,
чтобы он покрыл гель на 4-5 мм. Выставляют пробирки с продуктами
амплификации в штатив в два ряда (на основе праймеров" chla" и "ВС-Л").
Из-под слоя масла отбирают 15 мкл амплификата и вносят на дно лунки
(например, амплификат пробы №6 из ряда "chla" вносят в одну полосу
геля, затем амплификат той же пробы из ряда "ВС-Л" - в другую полосу.
Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пипетируя 1-2
раза) буфером из камеры после внесения каждой пробы.
Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Если
нет нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны
подниматься пузырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения
10 В/см до того момента, как краситель (ксиленцианол) пройдет примерно
половину длины геля. Выключают источник тока, переносят гель на
трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх и
совместив уровень лунок (одна под другой) для удобства учета.
Просматривают расположение полос ДНК под ультрафиолетовым
излучением. (Глаза и лицо должны быть защищены специальной маской
или стеклянной пластиной).
Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в
проходящем ультрафиолете на чувствительную пленку типа "Микрат 300"
или поляроидную пленку. Документирование результатов можно проводить
с помощью других систем; insta doc i, insta doc ii (фотографирующие), gel
doc 1000 или Шатер ДВ (компьютерные).
6.5.3 Учет и интерпретация результатов.
Учет результатов ПЦР-анализа следует начинать с результатов
амплификации ДНК внутреннего стандарта. Все амплификаты "ВС-Л" (за
исключением "контролей ПЦР" - ДНК c.psittaci и деионизованная вода)
должны содержать полосу 500 п.н. Если в дорожке какой-либо исследуемой
пробы полоса внутреннего стандарта отсутствует, то отрицательный
результат анализа данной пробы на ДНК c.psittaci учитывать нельзя.
Положительные пробы должны содержать специфическую
светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности строго на том же
уровне, что и полоса с положительным контрольным образцом ДНК
c.psittaci В ярко положительных пробах может отсутствовать полоса ВС-Л
и результат учитывают как положительный при условии правильного учета
результатов анализа "контролей".
Отрицательными считаются пробы, которые содержат только полосу
ВС-Л.
Кроме полос 1033 п.н. и 500 п.н. в дорожках могут наблюдаться
нечеткие размытые пятна праймер-димеров, которые располагаются ниже
уровня 100 н.п. (в нижней части дорожки).
Интерпретация результатов анализа:
Результат ПЦР-анализа
|
Результат амплификации исследуемой пробы
|
.
|
с праймерами на ДНК ВС-Л
|
с праймерами на ДНК С.psitaci
|
Положительный
|
+
|
+
|
Положительный
|
-
|
+
|
Отрицательный
|
+
|
-
|
Недействительный
|
-
|
-
|
Учет результатов амплификации контрольных образцов:
.
|
Название реагента
|
с праймерами "ВС-Л"
|
с праймерами на "С.psitaci"
|
"контроли"
1-го этапа
|
Физиологический раствор
|
+
|
-
|
Элюирующий буфер
|
+
|
-
|
ДНК С.psitaci 1:10
|
+
|
+
|
"контроли"
2-го этапа
|
ДНК С.psitaci 1:10
|
-
|
+
|
ДНК ВС-Л 1:10
|
+
|
-
|
Деонизированная вода
|
-
|
-
|
Если результаты анализа контрольных образцов не совпадают с
приведенными в таблице, то анализ считают недействительным и исследо-
вание повторяют.
При работе с материалом, содержащим много клеток, в ПЦР
участвует большое количество неспецифической геномной ДНК. При этом в
дорожках геля появляются характерные шмеры, равномерно
располагающиеся от лунки до самого низа дорожки или
концентрирующиеся около лунки. На фоне такого шмера в положительном
образце видна специфическая полоса, а в отрицательном образце полоса
отсутствует.
Результаты анализа не учитываются, если:
- в дорожке какой-либо пробы отсутствуют обе полосы.
Необходимо повторить исследование этой пробы с самого
начала. Возможная причина - ошибка на первом этапе работы,
приведшая к недостаточной сорбции ДНК или плохой очистке от
ингибиторов реакции.
- в дорожке любого отрицательного контроля выявляется
специфическая полоса. Возможно, произошла контаминация
реактивов и проб положительной ДНК или продуктами
амплификации положительной ДНК в процессе работы. Для
проверки реактивов необходимо поставить не менее трех
отрицательных контролей на этапе выделения ДНК и столько же
на этапе постановки ПЦР для выявления источника
контаминации. Если результат повторяется, необходимо сменить
реактивы.
- в дорожках появляются неспецифические полосы на разных
уровнях. Возможные причины; неправильное проведение
"горячего старта" или неверный температурный режим в ячейках
амплификатора.
7. Диагноз на орнитоз (пситтакоз) птиц считают предварительным:
- при выявлении специфических антител в сыворотке крови в РСК
(РНСК) или ИФА;
Диагноз на орнитоз (пситаккоз) птиц считают окончательным при при-
менении любого прямого метода диагностики, который выявляет:
- хламидии, антигены хламидий или ДНК хламидий в исследуемом
материале.
8. Сроки исследований:
- выявление специфических антител - от 1 до 5 дней;
- световая микроскопия - от 30 мин до 2 часов;
- люминесцентная микроскопия - около 40 мин;
- выделение и идентификация хламидий - от 7 до 30 дней;
- выявление ДНК хламидий - от 4 до 5 часов
С утверждением настоящего наставления утрачивают силу
"Методические указания по лабораторной диагностике орнитоза (пситтако-
за) птиц", утвержденные Главным управлением ветеринарии Министерства
сельского хозяйства СССР от 9 ноября 1988 года.
.gif)