МИНИСТЕРСТВО                            
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
  И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                             
 РОСcИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                                  УТВЕРЖДАЮ 
                                                                                  Заместитель руководителя
                                                                                  Департамента ветеринарии
№ 13-7-2/5 от 16 февраля 1999 г.                                      В.В.Селиверстов


                     Методические указания
            по определению общего микробного числа
         в продуктах животного происхождения и объектах
                        внешней среды

            1. Общие положения

Метод серийных разведений в полужидком агаре с
последующим высевом капли испытуемого образца на
поверхность мембранного фильтра предназначен для
практических исследований при определении санитарного
качества продуктов животного происхождения, объектов
внешней среды, включая водные источники естественного
бассейна и сточные воды. Метод может быть использован в
экспериментальной научно-исследовательской работе при
определении выживаемости бактерий как в исходном, так и
при воздействии различными инактивирующими факторами
(биотическими, антропогенными, абиотическими).

2. Методика определения общего микробного числа
методом серийных разведений в полужидком агаре с
последующим высевом капли агара на мембранные
фильтры.

Сущность метода заключается в том, что в качестве
раствора для разведения используется полужидкий мясо-
пептонный агар (0,6-0,8 %), капли которого высеваются на
мембранные фильтры, расположенные на поверхности мясо-
пептонного агара в чашке Петри.

Анализ испытуемых образцов капельным методом
осуществляется поэтапно:

1. Мясо-пептонный агар в стерильных условиях
разливается в стерильные стеклянные или пластмассовые
чашки Петри (диаметром 9 см). На поверхность агара наносят
3-4 стерильных мембранных фильтра (диаметром 30 мм, №
2-5) (см. приложение 1).

2. 0,6-0,8 %-ый полужидкий мясо-пептонный агар (см.
приложение 2) разливают по 9 куб.см  в пробирки и сохраняют в
водяной бане или термостате при З8-З9 гр.С, для того, что бы
полужидкий агар не застывал.

3. В полужидком мясо-пептонном агаре готовят
десятичные разведения исследуемого образца. Для этого в
первую пробирку с 9 куб.см полужидкого агара вносят 1 куб.см
испытуемого образца, затем тщательно перемешав 1 куб.см
испытуемого образца из первой пробирки переносят во
вторую и т.д.

4. На поверхность мембранных фильтров наносят по 1
капле (0,1 мл) испытуемого образцам капли агара наносят по
кругу на одинаковом расстоянии друг от друга с интервалом 2
см, от края чашки отступают на 2 см. В одну чашку можно
разместить по 3-4 капли агара с различными разведениями
испытуемого образца. Капли агара с разведенной культурой
застывают через 10-15 минут, чашки Петри с застывшими
каплями испытуемого образца культивируют при 37° С, 48 ч.

5. Для определения общего микробного числа подсчет
колоний в каплях агара проводят при хорошем освещении.
Подсчет числа колоний проводится по формуле:
     n
х = a х 1,0, где
х- общее микробное число,
а - количество выросших колоний,
n - степень разведения.

То есть для определения общего микробного числа
количество выросших колоний умножают на степень
разведения культуры.

6. Для того, чтобы улучшить визуальную видимость
выросших колоний можно проводить фиксацию колоний в
парах 25 %-го глутарового альдегида 30-40 минут (колонии
приобретают слегка желтоватый цвет). Таким образом
фиксированные колонии легко подсчитать, кроме того
создается безопасность при работе с патогенными
микроорганизмами.

7. В случае роста мелких слабо различаемых колоний
можно использовать световой микроскоп (х 10). Для этого
зафиксированные в парах мембранные фильтры помещают
на поверхность предметных стекол и просветляют
несколькими каплями ацетона, при этом мембранный фильтр
становится прозрачным, что обеспечивает подсчет мелких
колоний.

Предлагаемый метод прост в исполнении, информативен,
дает хорошо воспроизводимые и статистически достоверные
результаты; позволяет значительно сократить расход
питательных сред, стерильной бактериологической посуды и
времени проведения анализа.


Приложение 1.

Стерилизация мембранных фильтров.

Мембранные фильтры можно стерилизовать несколькими
способами: кипятить в течение 15-20 мин или стерилизовать
паром, поместив между листками фильтровальной бумаги в
чашку Петри на 30 мин в аппарате Коха, или стерилизовать
ультрафиолетовыми лучами с растояния около 40 см в
течение 60-120 мин. В качестве источника ультрафиолетовых
лучей используют, например, БУВ-6О.


Приложение 2.

Состав полужидкого агара для разведения.

Состав полужидкого 0,6-0,8 % мясо-пептонного агара для
разведения: 1 куб.дм дистиллированной воды, 10 г пептона, 5 г
натрия хлорида, 0,3 г безводного КН2РО4, 0,6 г безводного
nа2НРО4  и 0,6-0,8 г агар-агара, (рН среды 7,0-7,2). Среду
стерилизуют 30 минут при 112 гр.С.

Методические рекомендации разработаны:
Всероссийским научно-исследовательским институтом
ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (И.Б.Павлова,
Д.А.Банникова), Московским государственным университетом
прикладной биотехнологии (Е.М.Ленченко, М.Ю.Штукарева),
Департаментом ветеринарии Минсельхоапрода России
(В.И. Белоусов)


Рис.1.Определение общего микробного числа методом
серийных разведений в полужидком агаре,с последующими
высевом капли агара на поверхность МПА.Общее микробное
           7
число-17х10.

Рис.2.Определение общего микробного числа методом 
серийных разведений в полужидком агаре,с последующим
высевом капли агара на поверхность ацетатного фильтра,
расположенного на поверхности МПА,фиксация парами осмия.
                             7
Общее микробное число- 2 х 10 .